基于肽和蛋白质的药物是一类快速扩展的治疗药物，用于治疗多种健康状况，包括癌症、代谢和自身免疫性疾病、HIV等。生物药物，如单克隆抗体，来源于生物体，通常非常昂贵。由于许多生物制剂正在脱离专利，市场已经准备好节约成本的生物制剂。但是所有的蛋白质，包括单克隆抗体，都有复杂的结构来影响它们的功能。结构差异将改变生物活性，导致药物的安全性和疗效发生变化。

ICH Q6B是一份指导文件，为生物技术产品和生物制品提供了一套国际公认的质量标准，以支持新的上市申请。它确立了原液、制剂或物料应符合的预期用途可接受标准。

在ICH Q6B中列出了水解后测定的氨基酸组成，作为通过与从所需产品的基因序列推导出的氨基酸组成进行比较来表征蛋白质并确认其同一性的一种方法。氨基酸分析数据也用于准确测定蛋白质含量。

使用柱后衍生化进行氨基酸分析是一种非常灵敏、可重现和耐用的方法，并且是运行生物样品、蛋白质、肽和食品分析的实验室的首选方法。Pickering提供多种氨基酸分析产品，包括柱后衍生仪器、色谱柱、洗脱剂、试剂和标准品。所有产品设计为协同工作，为任何选定的样本提供最佳结果。

方法

分析条件

色谱柱：高效钠离子交换柱，4.6 x 110 mm，货号 1154110T

保护柱：阳离子交换 GARDTM，目录号 1700-3102

流速：0.6 毫升/分钟

流动相：参见表 1 中的方法进样体积：10-50 uL

柱后条件

柱后系统：Onyx PCX 或 Pinnacle PCX 反应器体积：0.5 mL

反应器温度：130°C

流速：0.3 毫升/分钟

检测：一级氨基酸 UV/VIS 570 nm，二级氨基酸 440 nm

图 1. 氨基酸标准品的色谱图

图2 IL-17F单克隆抗体水解样品色谱图

1 天冬氨酸2 苏氨酸3 丝氨酸4 谷氨酸5 脯氨酸6 甘氨酸7 丙氨酸8 胱氨酸9缬氨酸10 蛋氨酸11 异亮氨酸 丙氨酸 12 亮氨酸

13 正亮氨酸14 酪氨酸15 苯丙氨酸16 组氨酸17 赖氨酸18 色氨酸 19 氨 20 精氨酸21 半胱氨酸 22 牛磺酸

根据欧洲药典进行氨基酸分析

欧洲药典 (Ph. Eur.) 定义了对药物的定性和定量成分的要求，以及对药物及其生产中使用的物质和材料进行的测试。

它涵盖了化学、动物、人类或草药来源的活性物质、赋形剂和制剂、顺势疗法制剂和顺势疗法原料、抗生素以及剂型和容器。它还包括对生物制品、血液和血浆衍生物、疫苗和放射性药物制剂的测试。欧洲药典及其要求在欧洲药典公约成员国和欧盟具有法律约束力。

因此，所有药品或药用物质的制造商都必须申请 Ph. Eur。质量标准，以便能够在欧洲销售和使用这些产品。

氨基酸分析可用于：

- 通过氨基酸组成分析对生物制药活性成分（例如肽、蛋白质）进行鉴定测试；

- 原料药（活性药物成分，例如游离氨基酸）和中间体的杂质和相关物质测定；

- 药物产品中的单一或总氨基酸定量，包括复杂基质中的标记物测定

（例如植物药物）。

以下Ph.Eur。专着已经正式介绍了以柱后茚三酮衍生化作为测定茚三酮阳性物质所需的分析程序的氨基酸分析方法，预计未来几个月还将发表更多论文：

- 盐酸半胱氨酸一水合物 01/2014:0895 - 异亮氨酸 07/2013:0770

- 亮氨酸 07/2013:0771

- 赖氨酸盐酸盐 07/2013:0930

- 丝氨酸 01/2014:0788

- 脯氨酸 01/2014:0785

- 苏氨酸 01/2014:1049 - 缬氨酸 01/2014:0796

- 精氨酸 07/2014:0806

Pickering 根据欧洲药典提供完整的氨基酸分析解决方案。这包括 Onyx PCX 柱后衍生仪器、分析柱和保护柱、缓冲液和Trione®茚三酮试剂。 Onyx PCX 能够执行柱温梯度，允许轻松修改条件并改善运行时间和氨基酸分离。本应用简报中介绍的方法经过优化，符合药典方法的系统适用性要求。

每部药典专论都描述了针对每种氨基酸的测试和参比溶液的制备。这些溶液用于计算百分比含量、杂质水平以及系统适用性参数。亮氨酸和异亮氨酸峰之间需要 1.5 的分辨率。

表 1 总结了每个专着中使用的解决方案。

表 1. 药典方法参考指南

Cys = 半胱氨酸，CSSC = 胱氨酸，Lys = 赖氨酸，Ser = 丝氨酸，Thr = 苏氨酸，Val = 缬氨酸，

Ala = 丙氨酸，Arg = 精氨酸，Ile = 异亮氨酸，Leu = 亮氨酸，Pro = 脯氨酸，NH4 = 氨

对于除半胱氨酸以外的所有氨基酸，可以使用基于钠和基于锂的方法。 对于半胱氨酸分析，只有基于锂的方法是合适的。 基于钠的方法运行时间较短，适用于除半胱氨酸以外的所有氨基酸。

使用高效钠柱分析以下氨基酸的方法：

缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸

分析条件

色谱柱：高效钠离子交换柱，4.6 x 110 mm，货号 1154110T

保护柱：阳离子交换 GARDTM，目录号 1700-3102

流速：0.6 毫升/分钟

流动相：参见表 2 中的方法进样体积：50 uL

柱后条件

柱后系统：Onyx PCX 或 Pinnacle PCX 反应器体积：0.5 mL

试剂： Trione®

试剂温度：130°C

柱温：见表 3 中的方法

流速：0.3 毫升/分钟

检测：一级氨基酸 UV/VIS 570 nm，二级氨基酸 440 nm

表3. 柱温箱程序

表 2. 色谱柱 1154110T 的 HPLC程序 

使用药典方法分析的替代氨基酸的钠色谱图（每个 3 ug/mL， 50 uL注射液）

使用药典方法分析的氨基酸的钠色谱图（每种 3 ug/mL， 50 uL注射液）

产品

使用药典方法分析的替代氨基酸的钠色谱图（每个 3 ug/mL， 50 uL注射液）

低浓度异亮氨酸参考溶液的钠色谱图 – 0.12 ug/mL。 进样量 50 uL

600 ug/mL 异亮氨酸测试溶液的钠色谱图（放大）。 进样量 50 uL

600 ug/mL 脯氨酸测试溶液的钠色谱图（放大）。 进样量 50 uL

缬氨酸测试溶液 600 ug/mL 的钠色谱图（放大）。 进样量 50 uL

600 ug/mL 亮氨酸测试溶液的钠色谱图（放大）。 进样量 50 uL

600 ug/mL 亮氨酸测试溶液的钠色谱图（放大）。 进样量 50 uL

由于半胱氨酸和脯氨酸峰分离不佳

对于钠基法，根据药典，需要使用锂高效柱进行半胱氨酸分析。相同的锂方法可用于所有其他氨基酸，但分析时间比钠方法长。

使用高效锂柱分析以下氨基酸的方法：

半胱氨酸、缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸

分析条件

色谱柱：高效锂离子交换柱，4.6 x 75 mm，货号 0354675T

防护：阳离子交换 GARD^TM，目录号 1700-3102

流速： 0.55毫升/分钟

流动相：参见表  4中的方法进样体积：50 uL

柱后条件

柱后系统： Onyx PCX或  Pinnacle PCX反应器体积：0.5 mL

试剂： Trione®

试剂温度：130 ^oC

柱温：见表  5中的方法

流速： 0.3毫升/分钟

检测：一级氨基酸 UV/VIS 570 nm，二级氨基酸 440 nm​

表4 色谱柱 0354675T 的 HPLC 程序                                                                                            表5. 柱温箱程序

用作半胱氨酸分析参考溶液的氨基酸的锂色谱图（每种 3 ug/mL，50 uL 进样量）                               使用药典方法分析的氨基酸锂色谱图（每种 3 ug/mL，50 uL 进样）

为了更轻松地开始使用 Pickering的方法，我们提供了化学试剂盒，其中包括：分析柱、GARD、缓冲液、试剂和用于氨基酸分析的分析标准品。 如果需要，套件中的所有物品都可以单独订购。 如果您对此应用有任何疑问，请联系  Pickering。